LightCycler® 480 SYBR Green I Master 是一種用于 PCR 的單組分熱啟動反應混合物。它包含 FastStart Taq DNA 聚合酶和 DNA 雙鏈特異性 SYBR Green I 染料，用于 PCR 產物檢測和表征。由于該混合物作為易于使用的多合一主試劑提供，因此反應設置只需要添加模板DNA和引物。該混合物可與不同類型的 DNA（例如基因組 DNA 或 cDNA）一起使用，適用于 LightCycler® 480 儀器上 96 孔板或 384 孔板的高通量應用。
應用
LightCycler® 480 SYBR Green I Master專為研究而設計。當與 LightCycler® 480 系統(tǒng)一起使用時，該試劑盒非常適合熱啟動 PCR 應用。結合 LightCycler® 480 系統(tǒng)和合適的 PCR 引物，該試劑盒可以fei常靈敏地檢測和定量確定的 DNA 序列。該試劑盒還可用于執(zhí)行兩步 RT-PCR。它也可以與熱不穩(wěn)定的尿mi啶-DNA糖基化酶一起使用，以防止PCR過程中的殘留污染。
原則上，該試劑盒可用于擴增和檢測任何DNA或cDNA靶標。
原則
LightCycler 480 SYBR Green I Master 是一種即用型反應混合物，專為在 LightCycler®® 480 儀器上應用 SYBR Green I 檢測格式而設計。它用于在 96 或 384 多孔板中進行熱啟動 PCR。熱啟動PCR已被證明通過在反應開始時最大限度地減少非特異性擴增產物的形成，顯著提高PCR的特異性和靈敏度[Chou Q等人，1992和Kellogg DE，等人，1994]。
FastStart Taq DNA 聚合酶是一種化學修飾形式的熱穩(wěn)定重組 Taq DNA 聚合酶，在高達 75°C 的溫度下沒有活性。 該酶僅在高溫下具有活性，其中引物不再非特異性結合。在循環(huán)開始之前，酶在單個預孵育步驟（95°C，5 - 10分鐘）中wan全激活（通過去除封閉基團）。激活不需要其他熱啟動技術典型的額外處理步驟。
PCR產物的產生可以通過測量SYBR綠I熒光信號來檢測。SYBR Green I插入DNA螺旋（5）。在溶液中，未結合的染料表現出很少的熒光;然而，熒光（波長，530 nm）在DNA結合時大大增強。因此，在PCR過程中，SYBR Green I熒光的增加與產生的雙鏈DNA量成正比。由于SYBR Green I染料非常穩(wěn)定（在30個擴增循環(huán)中只有6%的活性損失），并且LightCycler® 480儀器的光學濾光片組與激發(fā)和發(fā)射波長相匹配，因此它是測量總DNA的shou選試劑。
在光循環(huán)儀® 480系統(tǒng)上進行實時熒光定量PCR期間，使用SYBR Green I進行DNA檢測的基本步驟是：
為了證明只有您想要的PCR產物被擴增，您可以在PCR后進行熔解曲線分析。在熔解曲線分析中，反應混合物緩慢加熱至97°C，這導致雙鏈DNA熔解并相應降低SYBR Green I熒光。儀器持續(xù)監(jiān)測這種熒光降低，并將其顯示為熔解峰。每個熔解峰代表特定DNA產物的特征解鏈溫度（Tm）（其中DNA為50%雙鏈和50%單鏈）。決定dsDNA的Tm的最重要因素是該片段的長度和GC含量。如果PCR僅產生一個擴增子，則熔解曲線分析將僅顯示一個熔解峰。如果存在引物二聚體或其他非特異性產物，它們將顯示為額外的熔點峰。因此，檢查PCR產物的Tm可以與在凝膠電泳中按長度分析PCR產物進行比較。
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